“内质网”科学家成功筛选固氮缺失的突变体，为解决粮食安全和氮素污染贡献力量

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来源：DeepTech深科技

氮，是植物必需的首要营养元素。氮肥的缺乏会导致营养危机，而过量施用氮肥又会带来严重的环境问题。上述情况在中国尤为突出，中国耕地面积占全世界比例约为 7-8%，人口占全球比例约为 18%，化肥施用量占比却达到 33% 左右。在保证农作物产量的前提下，我们亟需找到一条减少氮肥施用的农业生产新途径。

豆科植物与固氮根瘤菌的共生关系是一种非常有趣和奇妙的生物现象，它使得豆科植物能够在氮元素缺乏的土壤中生长，从而使其能在更广阔的地域中生存和繁衍。简单来说，植物宿主给根瘤菌提供碳营养。作为交换，根瘤菌利用空气中的氮气为植物提供氮素营养。通过共生固氮，豆科植物减少了对于工业合成氮肥的依赖。

因此，研究豆科植物共生固氮，对于农业可持续发展和生态环境保护具有重要意义。豆科植物和根瘤菌之间的信号交流和分子调控机制，复杂而精妙。其中涉及到双方的信号识别、蛋白分泌、共生体形成和分化、固氮调控等一系列分子机制。

由此可见，揭示豆科植物固氮共生的新调控因子和分子机制，能为提高豆科植物的固氮能力和效率奠定理论基础，并有助于将固氮能力转移到非豆科植物中，为解决全球粮食安全和氮素污染问题贡献力量。

豆科植物的共生固氮，发生在豆科特有的器官-根瘤中。根瘤菌会通过侵染线，完全进入根瘤细胞内部，从而被包裹在植物的膜结构中，进而形成一种特殊的细胞器样结构——共生体。共生体由三部分结构组成：最外层是一层来自宿主植物的膜结构，被称为共生体膜；最内层为分化的根瘤菌，被称为类菌体；中间为胞质样的溶液，被称为类菌体周质空间。

对于类菌体中的固氮酶来说，它能将空气中的氮气（N2）还原成氨（NH3），从而为植物提供氮源。共生体的分化是共生固氮成功的前提，这一过程受到植物分泌蛋白的调控。然而，植物细胞如何适应大量的蛋白分泌、以及分泌蛋白如何到达共生体，对于这些问题人们依旧还不清楚。

信号肽，是决定蛋白分泌方向的关键因素。它通常位于新合成的蛋白质的 N 端。新生多肽在游离核糖体上合成之后，通过易位通道进入内质网腔。在内质网中，信号肽会被信号肽酶切复合体（Signal peptidase complex，SPC）识别并切割下来。成熟蛋白则被包装进入运输囊泡，随后被送往目标位置。而信号肽则留在内质网上等待进一步处理。

在豆科模式植物蒺藜苜蓿中，人们已经发现一种根瘤特异性表达的信号肽酶（Signal peptidases，SPs）——DNF1。DNF1，是 SPC 的组分之一。DNF1 能切割掉一些特殊的信号肽比如 NCR 多肽等，使得这些蛋白能够分泌到共生体上，进而调控共生体的分化。

如果 DNF1 缺失，这些蛋白就无法正常分泌，导致共生体不能发育成熟，以至于形成无效的根瘤。信号肽酶通常与信号肽蛋白酶（Signal peptide peptidases，SPPs）协作完成信号肽的去除，前者负责将信号肽从新合成的蛋白上切下来，后者负责将切下来的信号肽水解掉。

DNF1 的发现表明：植物细胞中存在一条共生特异性的分泌途径。那么，在这条途径中是否也存在一个共生特异性的信号肽蛋白酶？

为研究这一问题，湖南大学教授潘怀荣团队从蒺藜苜蓿突变体库中，筛选一个固氮缺失的突变体——bid1。bid1 突变体表现出明显的缺氮表型，例如植株矮小、瘦弱、叶片发黄等。

而 bid1 所形成的根瘤，是一种不具有固氮能力的白色圆形小根瘤，根瘤细胞中的共生体不能正常分化，与体外游离生长的根瘤菌类似。

通过图位克隆和全基因组测序，他们发现 bid1 突变体中 1 号染色体和 2 号染色体存在大规模的染色体变异，2 号染色体上一段 8.8kb 的序列异位到了 1 号染色体上基因 BID1 的启动子区域，这一突变导致 BID1 的表达显著下调。

通过遗传互补实验，他们证实这一突变导致了 bid1 的突变表型。BID1 编码信号肽蛋白酶，负责降解从信号肽酶切复合体切割下来的滞留在内质网上的信号肽。

通过组织表达分析和亚细胞定位分析，该团队发现 BID1 具有非常特异的表达模式，BID1 特异地定位在根瘤中被根瘤菌侵染细胞的内质网上。BID1 的缺失，会导致内质网结构和功能的紊乱。而在 bid1 突变体中，内质网会胁迫相关基因来诱导表达。不仅如此，内质网的正常结构也会被破坏，这时的内质网呈现出膨大、聚集的状态。

与此同时，内质网与共生体之间的紧密联系也被打断，内质网不再紧密包裹在共生体周围，而是在细胞质中散乱分布。也就是说，内质网结构的异常会导致其蛋白分泌的功能。该团队发现在 bid1 突变体中，NCR001 的蛋白并不能像野生型一样正常分泌到共生体上。

以上结果表明，作为共生特异的信号肽蛋白酶，BID1 是根瘤细胞中内质网和共生体信号传递途径的关键元件。在内质网残留信号肽的清除、维持内质网正常的结构和功能中，BID1 具有重要功能。

客观来说，这是一个基础研究成果。如果对应用进行展望的话，根瘤特异的 BID1 基因可能是共生体终末分化、固氮共生效率较高的一类豆科植物所特有的，通过对大豆等豆科植物的 BID1 基因进行改造，可能会提高这些作物的固氮共生效率。

据介绍，该实验室的主要研究内容是通过正向遗传学方法，从蒺藜苜蓿固氮缺失突变体中，克隆共生固氮相关的新基因。基本研究逻辑在于：如果某个突变体有严重的共生固氮缺陷表型，那么它的目的基因应该是共生固氮信号网络的关键节点。

该团队所采用的方法是图位克隆结合全基因组测序。整个实验的流程大致包括以下几个步骤：

其一，鉴定突变体的表型。对于从蒺藜苜蓿快中子轰击突变体库中获得的突变体进行表型鉴定，筛选出固氮缺失的突变体。固氮缺失突变体，指的是能形成根瘤但是根瘤却不具备固氮能力的突变体。这些根瘤通常呈白色圆形，根瘤细胞中的共生体可能不能存活，也可能能存活，但是不能正常分化，不管是哪种情况，都会导致根瘤固氮能力的丧失。

其二，图位克隆和全基因组测序。图位克隆是一种基因克隆的方法，它不需要知道目的基因的 DNA 序列或表达产物，而是根据目的基因在染色体上的位置进行克隆。研究中，课题组用分子标记对目的基因进行遗传定位，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，从而将目的基因定位到一个较小的染色体区间内，随后通过全基因组测序确定具体的位点和突变涉及的基因。确定候选基因后，通过遗传互补确定是否由候选基因的突变导致的突变体表型。

其三，基因的功能分析。通过组织表达模式分析、亚细胞定位分析，课题组确定了 BID1 定位在根瘤中被根瘤菌侵染的细胞的内质网上。通过系统性的进化分析，他们发现 BID1 是 IRLC 分枝特异的信号肽蛋白酶。

随后，其又通过荧光共聚焦显微开展观察，并采用透射电镜连续切片结合内质网 3D 重构等方法，证实 BID1 缺失会影响内质网的结构和功能。整体来看，目前对于 BID1 基因的认识还非常肤浅，有大量的后续工作有待开展。

例如，研究人员已经知道 BID1 剪切内质网膜上的信号肽残余片段，但是具体有哪些信号肽片段是 BID1 的直接底物，目前并不清楚。同时，根据在哺乳动物细胞中的论文报道，信号肽蛋白酶还可能有一些其它底物，在根瘤细胞中 BID1 的直接底物蛋白还有哪些？现在也还需要继续鉴定。后续，他们计划通过蛋白质组学的方法，对 BID1 蛋白的直接底物进行高效筛选。

另外，目前人们对于调控根瘤细胞中内质网-共生体信号转运的内质网蛋白依旧所知甚少，课题组也希望通过正向遗传学和反向遗传学方法，找到更多的与 BID1 协同起作用的蛋白。

参考资料：

1.Yang, J., Zhai, N., Chen, Y. et al. A signal peptide peptidase is required for ER-symbiosome proximal association and protein secretion. Nat Commun 14, 4355 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40008-3

运营/排版：何晨龙

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